氮哌酮的危害及檢測目的
氮哌酮是一種丁酰苯類神經(jīng)安定藥，動物使用后可消除緊張感，使其活動力下降，對環(huán)境淡漠并長期處于安靜狀態(tài)。有助于降低因應(yīng)激及創(chuàng)傷引起的死亡率，因此在長途運輸中常常給豬等動物使用該藥。氮哌醇是氮哌酮在動物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，與原藥氮哌酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)相近，是氮哌酮的殘留標示物。通過食物鏈氮哌酮及其代謝產(chǎn)物氮哌醇會對人體產(chǎn)生直接的危害。為此我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和國家市場監(jiān)督管理總局2019年發(fā)布的GB 31650-2019《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》中明確規(guī)定了氮哌酮及其殘留標示物氮哌醇在豬靶組織中的殘留限量。
本文闡述了如何將氮哌酮及其代謝物從樣品基質(zhì)中分離提取出來，并經(jīng)過凈化后，轉(zhuǎn)化成高效液相色譜可以檢測的形式。以提取、凈化為重點，依據(jù)國標GB 29709-2013，為檢測人員和相關(guān)領(lǐng)域研究人員提供一定的參考。
檢測項目：氮哌酮、氮哌醇
應(yīng)用范圍：豬的肌肉、皮+脂、肝臟和腎臟
高效液相色譜法
方法原理：試樣中殘留的氮哌酮和氮哌醇用乙腈萃取，正己烷除脂，MCX柱凈化，高效液相色譜測定，外標法定量。
前處理儀器：
分析天平（感量0.01 g 和0.00001 g）；冷凍高速離心機；氮吹儀；旋渦混合器；固相萃取裝置；超聲波清洗機；均質(zhì)機；離心管；濾膜（0.2 μm）。
檢測儀器：HPLC +PDA
樣品的制備與保存
取新鮮或冷凍空白組織、供試組織，去除筋膜，絞碎，并使均質(zhì)。
取均質(zhì)后的供試樣品，作為供試試料。
取均質(zhì)后的空白樣品，作為空白試料。
取均質(zhì)后的空白樣品，添加適宜濃度的標準工作液，作為空白添加試料。
試料于零下20 ℃ 以下保存。
前處理方法
1.提取
稱取試樣5 g±0.05 g，于離心管中，加乙腈10 mL，旋渦混合1 min，超聲2 min，5000 r/min離心5 min，取上清液，殘渣中加乙腈10 mL重復(fù)提取一次，合并兩次上清液。于40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸干。用2 %甲酸水溶液5 mL溶解殘余物，加正己烷4 mL，混勻，5000 r/min離心5 min，棄正己烷層液，備用。
2.凈化
MCX柱依次用甲醇3 mL、水3 mL和2 %甲酸水溶液3 mL活化，取備用液過柱，控制流速小于1 mL/min，用2 %甲酸水3 mL和甲醇3 mL淋洗，抽干，用5 %氨化甲醇4 mL洗脫。收集洗脫液，于40 ℃氮氣吹干，用流動相（乙腈-乙酸銨溶液1+1）1.0 mL溶解殘余物，旋渦混勻，供高效液相色譜法測定。
國標解讀及注意事項
1.氮哌酮和氮哌醇標準物質(zhì)用甲醇配成1 mg/mL的標準儲備液，在零下20 ℃ 以下避光保存，有效期3 個月。
2.本方法使用乙腈兩次提取目標化合物，正己烷除脂，陽離子交換柱富集凈化，相當于5 g試料進行上機檢測。
3.MCX柱凈化方法為“酸上樣，堿洗脫”。
4.氨水甲醇溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，避免氨水揮發(fā)，影響洗脫效果；洗脫過程中洗脫溶劑少量多次加入，可以增加洗脫率。
5.固相萃取過程中需要控制流速，使溶液一滴一滴地流下，以保證離子交換的效果。