喹噁啉類藥物的危害及檢測(cè)目的
喹噁啉類藥物是一類化學(xué)合成類的抗菌促生長(zhǎng)劑，它們的基本結(jié)構(gòu)是喹噁啉-1,4-二氧化物，即喹噁啉環(huán)。主要包括喹乙醇、卡巴氧、喹喔啉、喹賽多、喹多辛、西諾喹多、德那資多（肼多司）、乙酰甲喹和喹烯酮等藥物。研究表明，喹噁啉類藥物對(duì)DNA致突變、致?lián)p傷，破壞細(xì)胞抗氧化作用系統(tǒng)，可以引起細(xì)胞自由基的產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞DNA發(fā)生氧化性損傷，還會(huì)引起細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。傳統(tǒng)喹噁啉類藥物喹乙醇和卡巴氧，由于其對(duì)人體危害最大，世界各國(guó)和國(guó)際組織對(duì)這兩種獸藥制定了嚴(yán)格的殘留限量規(guī)定。歐盟1998年發(fā)文禁止喹乙醇和卡巴氧在食品動(dòng)物生產(chǎn)中作為促生長(zhǎng)添加劑使用。2020年我國(guó)生效實(shí)施的GB 31650-2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》中規(guī)定了豬肌肉和豬肝臟組織中喹乙醇?xì)埩魳?biāo)志物的最大殘留限量。同年我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號(hào)規(guī)定卡巴氧及其鹽、酯為食品動(dòng)物中禁止使用的藥品。但是，這些藥物在生產(chǎn)實(shí)踐中被大量地非法使用或?yàn)E用，其殘留對(duì)消費(fèi)者健康造成了巨大的潛在威脅。喹乙醇和卡巴氧進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，能夠在短時(shí)間內(nèi)代謝成十多種產(chǎn)物，研究表明，3-甲基-喹噁啉-2-羧酸（MQCA）是喹乙醇在動(dòng)物體內(nèi)代謝后的主要產(chǎn)物，喹噁啉-2-羧酸（QCA）是卡巴氧在動(dòng)物體內(nèi)代謝后的主要產(chǎn)物，且該產(chǎn)物在動(dòng)物體內(nèi)滯留時(shí)間較長(zhǎng)，因其含量與總殘留關(guān)系穩(wěn)定，所以將MQCA定為喹乙醇在動(dòng)物體內(nèi)代謝的殘留標(biāo)示物，將QCA定為卡巴氧在動(dòng)物體內(nèi)代謝的殘留標(biāo)示物。
本文闡述了如何將卡巴氧、喹乙醇及代謝物從樣品基質(zhì)中分離提取出來，并經(jīng)過凈化后，轉(zhuǎn)化成液質(zhì)聯(lián)用儀可以檢測(cè)的形式。以提取、凈化為重點(diǎn)，依據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 20746-2006，為檢測(cè)人員和相關(guān)領(lǐng)域研究人員提供一定的參考。
檢測(cè)項(xiàng)目：卡巴氧、脫氧卡巴氧、喹噁啉-2-羧酸（QCA）、3-甲基-喹噁啉-2-羧酸（MQCA）
應(yīng)用范圍：牛、豬肝臟和肌肉
液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法
方法原理：
卡巴氧：用乙腈+乙酸乙酯（1+1）溶液提取肌肉和肝臟組織中的卡巴氧，提取液經(jīng)正己烷脫脂后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，殘?jiān)眉姿幔?.1 %）+甲醇（19+1）溶液溶解。樣液供液質(zhì)測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。
脫氧卡巴氧、QCA、MQCA：用甲酸溶液消化試樣，使組織中天然存在的酶失活，然后加入蛋白酶水解，鹽酸酸化，離心過濾后，過Oasis MAX固相萃取柱或相當(dāng)者凈化。先用二氯甲烷洗脫脫氧卡巴氧，再用2 %甲酸乙酸乙酯溶液洗脫QCA和MQCA，氮?dú)獯蹈上疵撘?，殘?jiān)眉姿?甲醇（19+1）溶液溶解，樣液供液質(zhì)測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。
前處理儀器：固相萃取裝置；氮?dú)鉂饪s儀；液體混勻器；分析天平（感量0.1 mg和0.01 g）；真空泵；均質(zhì)器；移液器（10 μL～100 μL和100 μL～1000 μL）；聚丙烯離心管（50 mL具塞）；pH計(jì)（測(cè)量精度±0.02 pH單位）；低溫離心機(jī)（可制冷到4 ℃）；玻璃離心管（15 mL）。
檢測(cè)儀器：HPLC-MS/MS+ESI源
試樣制備與保存
將牛、豬肝臟和肌肉組織樣品充分?jǐn)囁?，均質(zhì)，分出0.5 kg作為試樣，置于清潔樣品容器中，密封，并做上標(biāo)記。將制備好的試樣于-18 ℃以下保存。
前處理方法
1. 卡巴氧的前處理步驟
稱取5 g試樣（精確至0.01 g），置于50 mL聚丙烯離心管中，加入5 g中性氧化鋁，加入25 mL乙腈+乙酸乙酯（1+1）溶液，于液體混勻器上充分混合5 min，以5000 r/min離心5 min，將上清液移取至另一干凈的50 mL離心管，加入10 mL正己烷到管中，振蕩2 min，以5000 r/min離心5 min，棄去上層正己烷，將下層清液轉(zhuǎn)移至150 mL雞心瓶中。加入25 mL乙腈+乙酸乙酯（1+1）溶液，重復(fù)提取一次，正己烷除脂后合并兩次提取液于同一雞心瓶中，加入一定量的喹噁啉-2-羧酸-d4（QCA-d4）標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其濃度為2.0 ng/g，40 ℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。準(zhǔn)確加入1.0 mL 0.1 %甲酸-甲醇（19+1）溶液溶解殘?jiān)?，過0.2 μm濾膜后，供液質(zhì)測(cè)定。
2. 脫氧卡巴氧、喹噁啉-2-羧酸、3-甲基-喹噁啉-2-羧酸的前處理步驟
稱取5 g試樣（精確至0.01 g），置于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL 0.6 %甲酸溶液，混勻后，置于（47±3）℃振蕩水浴中振搖1 h；先加入3 mL1.0 mol/L Tris溶液混勻，再加入0.3 mL 0.01 g/mL蛋白酶水溶液，充分混勻后，置于（47±3）℃振蕩水浴中酶解16 h～18 h。加入20 mL 0.3 mol/L鹽酸溶液，振蕩5 min，在10 ℃以5000 r/min離心15 min，上清液過濾。將濾液移入Oasis MAX固相萃取柱（3 mL甲醇和3 mL水活化）中，待樣液全部流出后，用30 mL 0.05 mol/L乙酸鈉-甲醇（19+1）溶液淋洗固相萃取柱，真空抽干15 min。在一支干凈的玻璃管內(nèi)加入一定量的喹噁啉-2-羧酸-d4（QCA-d4）標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其濃度為2.0 ng/g，再用4×3 mL二氯甲烷將脫氧卡巴氧洗脫至管內(nèi)，在45 ℃用氮?dú)鉂饪s儀吹干。固相萃取柱再用3×3 mL甲醇、3 mL水、3×3 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液和2×3 mL甲醇-水（1+4）溶液分別淋洗，真空抽干15 min，然后用2 mL乙酸乙酯再淋洗固相萃取柱，棄去全部淋出液，最后用3 mL 2 %甲酸乙酸乙酯溶液洗脫喹噁啉-2-羧酸（QCA）和3-甲基-喹噁啉-2-羧酸（MQCA）到上述吹干的試管中，在45 ℃用氮?dú)鉂饪s儀吹干。準(zhǔn)確加入1.0 mL 0.1 %甲酸-甲醇（19+1）溶液溶解殘?jiān)?，過0.2 μm濾膜后，供液質(zhì)測(cè)定。
注意事項(xiàng)
1.標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別用甲醇配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，其中卡巴氧用二甲基甲酰胺配成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在-18 ℃保存，可使用1年。
2.本方法使用了喹噁啉-2-羧酸-d4（QCA-d4）同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行回收率的校正，也可以配合使用各個(gè)化合物相對(duì)應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)。
3.本方法各個(gè)化合物的提取凈化方法不同，原藥用乙腈+乙酸乙酯直接提取，代謝物需要酶解后過SPE小柱凈化，根據(jù)檢測(cè)需要選擇方法，具體方法見流程圖。
4.MAX固相萃取柱用于酸性化合物的凈化，過程是“堿上樣、酸洗脫”。淋洗后一定抽干小柱，防止水相進(jìn)入洗脫液。
5.氮?dú)鉂饪s過程中，吹至近干潮濕狀態(tài)，定容后采取渦旋加超聲的方式復(fù)溶，可以提高回收率。
6.該方法化合物檢出限為0.5 μg/kg，內(nèi)標(biāo)添加量為2.0 μg/kg。